Синтез РНК в «протоклетках» всё-таки возможен

   Окруженные липидными мембранами пузырьки — «протоклетки», в которых идет синтез РНК. Протоклетка растет за счет того, что в ее оболочку встраиваются молекулы жирных кислот, плавающие в окружающей среде в виде мицелл. Получающиеся нитевидные, ветвистые структуры распадаются на отдельные пузырьки при легком встряхивании. В протоклетки заранее помещены молекулы РНК с затравками-праймерами (двуспиральная часть молекулы) и однонитевым «хвостом», который нужно реплицировать. Активированные нуклеотиды из окружающей среды проникают в протоклетку путем диффузии. В присутствии комплекса из цитрата и ионов Mg²⁺ они участвуют в неферментативной репликации РНК. В результате достраивается фрагмент двойной спирали, выделенный красным цветом. Рисунок из дополнительных материалов к обсуждаемой статье в Science

Один из возможных сценариев зарождения жизни предполагает существование в прошлом «протоклеток» с липидной оболочкой, в которых шел неферментативный матричный синтез (репликация) РНК. Проблема в том, что ионы магния, катализирующие репликацию РНК, разрушают липидные мембраны и способствуют распаду однонитевых молекул РНК. Нобелевский лауреат Джек Шостак (Jack W. Szostak) и его ученица Катажина Адамала (Katarzyna Adamala) преодолели это препятствие, добавив в среду хелатирующий агент — цитрат. Оказалось, что ионы магния в комплексе с цитратом по-прежнему катализируют репликацию РНК, но уже не повреждают мембраны и однонитевые РНК. Это открытие позволило ученым создать искусственные протоклетки, внутри которых синтез РНК идет без помощи белковых ферментов и рибозимов.

Биологи и химики, пытающиеся раскрыть тайну зарождения жизни, параллельно разрабатывают несколько возможных сценариев. Некоторые модели (например, те, что связывают появление жизни с гидротермальными источниками того или иного типа) предполагают сравнительно позднее появление клеток, окруженных мембранами. Возможно, жизнь поначалу ютилась в микрополостях минералов в окрестностях вулканических источников, причем роль «клеточных мембран» выполняли полупроницаемые стенки таких полостей. Первые протоорганизмы могли быть комплексами самореплицирующихся полимеров, распластанными по поверхности минерала с подходящей кристаллической решеткой — будь то алюмосиликатная глина, пирит или сульфид цинка (см.: A. Mulkidjanian, 2009. On the origin of life in the Zinc world: 1. Photosynthesizing, porous edifices built of hydrothermally precipitated zinc sulfide as cradles of life on Earth). Такие сценарии, как правило, предполагают, что протоклетки, окруженные липидными мембранами, поначалу играли роль расселительной стадии в жизненном цикле протоорганизмов, привязанных к гидротермальным источникам и минеральным кристаллическим матрицам. Появились эти расселительные структуры уже после формирования эффективных механизмов репликации РНК, а возможно, даже после появления рибосом и белкового синтеза.

Но есть и другие сценарии, предполагающие, что протоклетки с липидной оболочкой, способные к росту и размножению (см. рисунок), появились очень рано — еще до того, как молекулы РНК научились эффективно катализировать собственную репликацию (о рибозимах-полимеразах см. в новости Рибозимы могут размножать друг друга, «Элементы», 13.04.2011; другой способ взаимного размножения рибозимов — сборка больших молекул РНК из нескольких маленьких — описан в новости Тайна происхождения жизни скоро будет разгадана?, «Элементы», 12.01.2009).

Именно такой сценарий вот уже несколько лет разрабатывает американский биолог Джек Шостак, получивший в 2009 году Нобелевскую премию (правда, за другое, а именно за изучение теломер и теломеразы).

О первых важных результатах, полученных командой Шостака, рассказано в новости Искусственные протоклетки синтезируют ДНК без помощи ферментов, «Элементы», 09.06.2008. Пять лет назад Шостаку и его коллегам удалось получить протоклетки, внутри которых происходит неферментативная (т.е. спонтанная, идущая без участия белковых ферментов или рибозимов) репликация коротких однонитевых участков ДНК.

Для этого ученые преодолели немало препятствий. Им пришлось подыскать реалистичную замену нуклеотид-трифосфатам — стандартным «строительным блокам», из которых современные клетки строят молекулы ДНК и РНК. Нуклеотид-трифосфаты принципиально не могут проходить сквозь липидные мембраны (потому что несут слишком большой положительный заряд). Пришлось заменить их на нуклеотиды, активированные имидазолом: из них тоже можно синтезировать ДНК и РНК, они не так сильно заряжены и их абиогенный синтез не представляется невероятным. Пришлось также поработать над мембранами, чтобы они легко пропускали нуклеотиды, активированные имидазолом, и чтобы их химический состав был реалистичным с точки зрения пребиотической химии (подробности см. в вышеупомянутой новости).

Но все-таки протоклетки, синтезирующие ДНК, не могут считаться правдоподобной моделью первых организмов. Ведь ДНК — позднее приобретение. Геномы древнейших организмов были сделаны из РНК (или из другого, но похожего по своим свойствам полимера, который впоследствии был заменен на РНК). Поэтому Шостаку и его коллегам очень хотелось создать протоклетку, внутри которой шла бы неферментативная репликация РНК.

Сделать это оказалось непросто (см.: J. W. Szostak, 2012. The eightfold path to non-enzymatic RNA replication). Неферментативный матричный синтез РНК — реакция осуществимая, но для того, чтобы она шла с приемлемой скоростью, в среде должна быть высокая концентрация ионов Mg2+. В этом случае к растущей нити РНК присоединяется до 1,4 нуклеотида в час.

Процесс идет медленно, но верно. Без ионов магния самое большее, на что можно рассчитывать, — это присоединение 0,03 нуклеотида в час. РНК — не настолько стабильная и долгоживущая молекула, чтобы позволить себе размножаться с такой черепашьей скоростью.

Проблема в том, что ионы магния безжалостно разрушают разработанные Шостаком и его коллегами замечательные, «пребиотически правдоподобные», проницаемые для нуклеотидов мембраны. Жирные кислоты, входящие в состав этих мембран, соединяются с Mg2+ и выпадают в осадок. Устойчивое существование протоклеток при концентрациях ионов магния, необходимых для эффективного синтеза РНК, оказалось невозможным.

Но это еще не всё. Ионы магния катализируют не только репликацию, но и распад однонитевых участков РНК. Поэтому в их присутствии еще неизвестно, успеет ли матричный синтез завершиться до того, как развалится матрица.

Кроме того, присутствие ионов магния повышает устойчивость двойных спиралей РНК (то есть температуру, при которой двойная спираль расплетается на две однонитевые молекулы). Это плохо, потому что для размножения РНК в отсутствие эффективных ферментов-полимераз очень важно, чтобы двойные спирали РНК разделялись без особого труда.

Итак, ионы магния необходимы для репликации РНК, но у них целых три негативных побочных эффекта: они разрушают мембраны, рвут однонитевые РНК, а двуспиральные РНК делают слишком тугоплавкими. Это заставило ученых задуматься о подборе хелатора, то есть такой молекулы, которая, соединяясь с ионом магния, обхватывала бы его, как клешня, и лишала некоторых каталитических свойств, сохранив нужные.

Авторы испытали множество хелаторов и обнаружили, что некоторые из них (в том числе цитрат, изоцитрат, оксалат и EDTA) эффективно защищают мембраны протоклеток от разрушения ионами магния.

Однако большинство из этих веществ лишило ионы магния также и способности катализировать репликацию РНК. Исключением оказался цитрат (анион лимонной кислоты): в его присутствии катализируемая ионами магния репликация лишь чуть-чуть замедлилась. Более того, цитрат полностью лишил ионы магния способности разрушать однонитевые молекулы РНК.

Установив эти факты, авторы перешли к решающему эксперименту. Они изготовили мембранные пузырьки — протоклетки с молекулами РНК внутри. К каждой однонитевой матрице заранее прикреплялся праймер — фрагмент комплементарной последовательности, образующий с матрицей двойную спираль (см. рисунок). При этом у матрицы оставался однонитевой хвостик, состоявший либо из нескольких нуклеотидов Ц (неферментативная репликация таких последовательностей идет быстрее всего), либо из чередующихся Г и Ц. Все молекулы РНК, оказавшиеся вне протоклеток, были тщательно удалены. Затем в среду, где плавали протоклетки, добавили хлорид магния, лимонную кислоту и нуклеотиды, активированные имидазолом.

Опыт удался: через 2–3 дня большинство однонитевых участков молекул РНК в протоклетках оказались полностью реплицированы, то есть молекулы стали целиком двуспиральными. В ходе работы авторы обнаружили, что репликацию можно ускорить, если не просто добавлять в раствор «пищу» (активированные нуклеотиды) по мере необходимости, а сделать систему проточной и удалять «отходы» (например, нуклеотиды, подвергшиеся незапланированному гидролизу) при помощи диализа.

Еще один небольшой, но приятный сюрприз ждал авторов, когда они проверили, не повлиял ли цитрат на температуру плавления двуспиральных РНК (которая, как мы помним, повышается в присутствии ионов магния). Оказалось, что температура плавления немного снизилась — с 75 до 71°C.

Таким образом, простейшая мера — добавление правильного хелатора — позволила преодолеть сразу несколько препятствий на пути к эффективной неферментативной репликации РНК в протоклетках.

Осталось понять, мог ли присутствовать абиогенно синтезированный цитрат в древних водоемах, служивших колыбелью зарождающейся жизни. До самого недавнего времени правдоподобные способы абиогенного синтеза цитрата не были известны. Ситуация изменилась в августе 2013 года, когда группа американских ученых сообщила о том, что им удалось найти реалистичный путь абиогенного синтеза щавелевоуксусной кислоты (оксалоацетата); см.: C. Butch et al., 2013. Production of Tartrates by Cyanide-Mediated Dimerization of Glyoxylate: A Potential Abiotic Pathway to the Citric Acid Cycle. От этого вещества до цитрата уже рукой подать (они соседи по циклу Кребса).

Однако авторы высказывают гипотезу, которая выглядит более интересной и глубокой, чем предположение о наличии абиогенного цитрата в «колыбели жизни». Роль хелатора, подавляющего негативные эффекты ионов Mg2+ и помогающего им катализировать репликацию РНК, могли взять на себя короткие пептиды, состоящие из нескольких аминокислот с отрицательно заряженными радикалами, таких как аспарагиновая кислота. Современные клеточные РНК-полимеразы имеют в своем активном центре ион магния, удерживаемый тремя остатками аспарагиновой кислоты. К тому же эта аминокислота часто встречается в метеоритах и легко образуется в опытах по абиогенному синтезу органики (таких как опыт Миллера, см.: Получены новые результаты старого эксперимента Стэнли Миллера, «Элементы», 20.10.2008). Наличие абиогенных аминокислот и простейших пептидов в «колыбели жизни» считается высоковероятным. С появления простых рибозимов, катализирующих соединение аминокислот друг с другом, скорее всего, началась эволюция белкового синтеза (см.: Тайна происхождения рибосом разгадана?, «Элементы», 27.02.2009). Авторы в настоящее время пытаются найти простые пептиды, способные помочь магнию катализировать репликацию РНК лучше, чем это делает цитрат. Пожелаем им успеха.